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  HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲線)同許多(duo)熒光PCR技術一(yi)樣(yang)，是利用特(te)定dsDNA染料可以插入DNA雙鏈(lian)小(xiao)溝中（PCR產物）的特(te)性(xing)，通過實時監測升溫過程(cheng)中dsDNA解鏈(lian)，熒光染料脫(tuo)落(luo)，熒光信號減弱或(huo)消失的過程(cheng)，高分辨記(ji)錄熔(rong)解曲線，從(cong)而對(dui)樣(yang)品(pin)進行檢測。HRM技術利用(yong)dsDNA的(de)(de)物理(li)性(xing)(xing)質，準(zhun)確反映DNA序列堿基(ji)配對特異性(xing)(xing)與(yu)解鏈溫(wen)度(du)變(bian)化(hua)的(de)(de)情況，無(wu)需使(shi)用(yong)特異性(xing)(xing)標(biao)記探針，不受突變(bian)種類和(he)突變(bian)位點(dian)的(de)(de)限制，具有高(gao)靈敏度(du)和(he)特異性(xing)(xing)、高(gao)通量、操作(zuo)簡單靈活(huo)、成本低等優點(dian)。實驗室檢測(ce)證(zheng)明，在PCR反應(ying)前或反應(ying)后(hou)加入飽和(he)dsDNA染料(liao)，對HRM分(fen)析，效(xiao)果相同。在PCR后(hou)加入，可閉管進行HRM分(fen)析，無(wu)需凝膠(jiao)電泳。HRM分(fen)析，不損傷PCR產(chan)物，用(yong)于HRM分(fen)析的(de)(de)PCR產(chan)物仍可用(yong)于電泳、膠(jiao)回收、測(ce)序等一(yi)系(xi)列后(hou)續操作(zuo)。HRM可應(ying)用(yong)于核(he)酸(suan)突變(bian)掃(sao)描(miao)、基(ji)因分(fen)型、甲(jia)基(ji)化(hua)檢測(ce)、短串聯(lian)重(zhong)復序列分(fen)析、序列匹配和(he)RNA編輯等多方面研究，已越來越受到(dao)國內外核(he)酸(suan)分(fen)子實驗室的(de)(de)歡(huan)迎和(he)重(zhong)視。

      對于(yu)目前絕大多數(shu)的突變分析方(fang)法來(lai)說(shuo)，都很(hen)難鑒定出純(chun)合(he)子序列(lie)突變。在(zai)一些(xie)不同種類的小的擴(kuo)增片(pian)段中，高分辨率熔解(jie)曲線則顯(xian)示出了鑒定純(chun)合(he)子序列(lie)突變的能力(li)，這種方(fang)法能鑒定出大多數(shu)的純(chun)合(he)突變。HRM技術在(zai)遺傳學研(yan)究方(fang)面也帶來(lai)很(hen)大便(bian)利，只需在(zai)PCR反(fan)(fan)應(ying)體系中加(jia)入雙鏈DNA飽和熒(ying)光染料，在(zai)PCR反(fan)(fan)應(ying)之后再花15 分鐘，就(jiu)可以完成96或384個(ge)樣品的DNA變異(yi)掃(sao)描。采(cai)用這種方(fang)法，當(dang)片(pian)段的大小在(zai)400bp或者更(geng)小時，靈敏性最高。

一、HRM分析條件

1. 設備

      PCR擴(kuo)增(zeng)產物的(de)(de)(de)熔解(jie)(jie)曲線完全取決于(yu)DNA堿(jian)基序列，序列中如有一(yi)個堿(jian)基發生突(tu)變(bian)，都會改(gai)變(bian)dsDNA的(de)(de)(de)解(jie)(jie)鏈溫度(du)。但(dan)是(shi)這(zhe)種(zhong)變(bian)化差(cha)異(yi)極(ji)小，只有零點幾攝氏度(du)，HRM技術(shu)需要(yao)區分(fen)(fen)(fen)Tm值差(cha)異(yi)極(ji)小的(de)(de)(de)樣品，以(yi)鑒別單個堿(jian)基的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)，因此(ci)，對溫度(du)分(fen)(fen)(fen)辨(bian)率的(de)(de)(de)要(yao)求相當高(gao)(gao)，如果(guo)儀器的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)辨(bian)率不(bu)高(gao)(gao)，是(shi)無法檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)。孔間溫度(du)差(cha)異(yi)（溫度(du)均一(yi)性(xing)：Tm的(de)(de)(de)標準偏差(cha)為0.020～0.264℃），孔間溫度(du)均一(yi)性(xing)要(yao)達到(dao)0.264℃以(yi)內才(cai)能(neng)保證(zheng)HRM分(fen)(fen)(fen)析(xi)結果(guo)的(de)(de)(de)準確性(xing)。熔解(jie)(jie)速率，最低(di)要(yao)求0.1℃/秒。數(shu)據(ju)密度(du)，最低(di)要(yao)求10個數(shu)據(ju)點/℃。目前市(shi)場上(shang)(shang)HRM分(fen)(fen)(fen)析(xi)儀器的(de)(de)(de)供應商，有專門用于(yu)HRM分(fen)(fen)(fen)析(xi)的(de)(de)(de)儀器，也有附帶(dai)HRM功能(neng)的(de)(de)(de)Real Time PCR儀。這(zhe)些(xie)廠(chang)家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology。市(shi)場上(shang)(shang)認可(ke)度(du)較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)一(yi)些(xie)設(she)備包括: HR-1、LightScanner-32、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc)，可(ke)采集55～95℃的(de)(de)(de)熒光信號，變(bian)溫速率是(shi)0.02～0.1℃／s，每(mei)秒鐘可(ke)以(yi)采集200個數(shu)據(ju)資料(liao)。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等傳(chuan)統實(shi)時定(ding)量PCR儀加裝高(gao)(gao)分(fen)(fen)(fen)辨(bian)率熔解(jie)(jie)模(mo)塊后，采用qPCR-HRM方法可(ke)以(yi)實(shi)現對目的(de)(de)(de)核酸片段(duan)的(de)(de)(de)定(ding)量和定(ding)性(xing)檢(jian)測(ce)。

2. 染料

      進行HRM分析(xi)的(de)(de)另(ling)一個必(bi)要條(tiao)件(jian)(jian)是(shi)飽(bao)(bao)和(he)染(ran)(ran)料。用(yong)于(yu)(yu)HRM分析(xi)的(de)(de)染(ran)(ran)料必(bi)須滿足兩個條(tiao)件(jian)(jian)。首先，必(bi)須是(shi)飽(bao)(bao)和(he)染(ran)(ran)料。所(suo)謂飽(bao)(bao)和(he)染(ran)(ran)料是(shi)指(zhi)染(ran)(ran)料必(bi)須能(neng)飽(bao)(bao)和(he)結(jie)合(he)于(yu)(yu)DNA雙(shuang)(shuang)鏈(lian)所(suo)有小(xiao)溝位置(zhi)，也(ye)就是(shi)染(ran)(ran)料相(xiang)對(dui)于(yu)(yu)dsDNA要相(xiang)對(dui)過量，以使dsDNA沒有更多(duo)位置(zhi)結(jie)合(he)染(ran)(ran)料，在dsDNA升溫解(jie)鏈(lian)時，飽(bao)(bao)和(he)染(ran)(ran)料從雙(shuang)(shuang)鏈(lian)上脫落，熒光信(xin)號同步(bu)減弱，準確(que)反(fan)應(ying)出樣品熔解(jie)溫度(du)（Tm）、熔解(jie)曲線的(de)(de)不(bu)同（如(ru)圖1-A）。SYBR Green I染(ran)(ran)料廣泛用(yong)于(yu)(yu)qPCR，但屬于(yu)(yu)非飽(bao)(bao)和(he)染(ran)(ran)料，不(bu)能(neng)封閉dsDNA的(de)(de)所(suo)有小(xiao)溝位置(zhi)，遠未(wei)將DNA雙(shuang)(shuang)螺旋結(jie)構中的(de)(de)小(xiao)溝飽(bao)(bao)和(he)。這(zhe)樣，DNA雙(shuang)(shuang)鏈(lian)高溫逐步(bu)變(bian)性(xing)時，部分熒光染(ran)(ran)料分子會隨機結(jie)合(he)到尚(shang)未(wei)解(jie)鏈(lian)的(de)(de)雙(shuang)(shuang)鏈(lian)DNA空置(zhi)的(de)(de)小(xiao)溝位置(zhi)，染(ran)(ran)料分子發生重排(pai)，造成熒光信(xin)號混亂，特異(yi)性(xing)下降(jiang)，不(bu)能(neng)準確(que)反(fan)映dsDNA解(jie)鏈(lian)過程(cheng)（如(ru)圖1-B）

圖1：dsDNA解(jie)鏈前后熒光(guang)染(ran)料(liao)結合情況。A(左(zuo)圖):飽(bao)和染(ran)料(liao)在(zai)dsDNA解(jie)鏈時，熒光(guang)分子同步脫落，信(xin)號減弱。B(右(you)圖):不(bu)飽(bao)和染(ran)料(liao)在(zai)dsDNA解(jie)鏈時，熒光(guang)分子重新(xin)結合于(yu)未解(jie)鏈的(de)dsDNA部位，熒光(guang)信(xin)號沒有變化，不(bu)能反應樣(yang)品熔解(jie)溫(wen)度(du)(Tm)。

       其次，染(ran)(ran)料(liao)(liao)(liao)不能抑(yi)制(zhi)PCR反應。SYBR Green I染(ran)(ran)料(liao)(liao)(liao)不是飽和染(ran)(ran)料(liao)(liao)(liao)，加(jia)大染(ran)(ran)料(liao)(liao)(liao)濃(nong)度，不但不能飽和結合dsDNA小溝位置，還會抑(yi)制(zhi)PCR反應進(jin)行，造(zao)成擴(kuo)增反應無序，混亂。

      用(yong)于HRM分析熒(ying)光染料如(ru)LC Green, Ly Green, eva Green等(deng)均為(wei)飽和(he)染料，能飽和(he)結合(he)于PCR反應(ying)產物的雙鏈小溝內，同時這些(xie)染料不會抑制PCR反應(ying)。Ly Green為(wei)2015年最新推出的HRM分析專(zhuan)用(yong)染料，除具有(you)飽和(he)染料、不抑制PCR等(deng)特點(dian)外，熒(ying)光信號穩定、實驗重復性好時期突出優(you)點(dian)（如(ru)圖2）。

圖(tu)2. LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析.

HRM分析(xi)設備為(wei)LightCycler@480熒光定量PCR儀(德(de)國羅氏)

二、HRM分析流程

1. 引物設計合成

       據基因(yin)序列應用Oligo軟件設(she)計、合成(cheng)正向(xiang)引(yin)物，反向(xiang)引(yin)物（或依據參考(kao)文獻）。將(jiang)引(yin)物稀(xi)釋成(cheng)10mmol/L的工作濃度,-20℃保(bao)存備用。

2. 反應體系

注：1）50μL反應，根據引物及擴增DNA長度不同，可進行優化。

2）染料在反應前加入或反應后加入對反應影響不大，反應前加入，可實現閉管操作。

3. 擴增及HRM程序

三、HRM分析局限性及解決辦法

1. 熔解設備自身溫差。在(zai)所有(you)的熔(rong)解(jie)系統(tong)中，孔與孔之間都存在(zai)微小的溫(wen)(wen)(wen)度(du)差(cha)異，故影響(xiang)檢測的靈敏性(xing)。如果孔與孔間的溫(wen)(wen)(wen)度(du)差(cha)異為0.1℃，則最終的樣品熔(rong)解(jie)溫(wen)(wen)(wen)差(cha)也可(ke)能是0.1℃。因此，HRM對儀器(qi)溫(wen)(wen)(wen)度(du)的均一(yi)性(xing)要求非常高。為解(jie)決這一(yi)問題(ti)，可(ke)以(yi)在(zai)PCR體系中加(jia)入(ru)2種溫(wen)(wen)(wen)度(du)內(nei)標(biao)，低溫(wen)(wen)(wen)時熔(rong)解(jie)和高溫(wen)(wen)(wen)時熔(rong)解(jie)。HRM儀上(shang)的分析(xi)軟件可(ke)以(yi)根(gen)據這2種內(nei)標(biao)的熔(rong)解(jie)峰(feng)在(zai)熔(rong)解(jie)曲(qu)線中的位置來(lai)糾(jiu)正孔與孔之間的溫(wen)(wen)(wen)度(du)差(cha)異，可(ke)顯著提高檢測的靈敏性(xing)。

2. PCR反應體系和反應條件。PCR反(fan)應(ying)體(ti)系中，核酸(suan)模(mo)板質量要(yao)經過檢測，濃(nong)度(du)要(yao)均一(yi)。在(zai)分(fen)析(xi)多樣(yang)本時，模(mo)板外的其他共同組分(fen)要(yao)先混(hun)合均勻后，再(zai)分(fen)別(bie)加入樣(yang)品模(mo)板，以保證反(fan)應(ying)體(ti)系的均一(yi)性(xing)。若在(zai)PCR反(fan)應(ying)后加入飽(bao)和熒光染料(liao)，通常不(bu)需要(yao)對反(fan)應(ying)條件做任何改變；若在(zai)PCR反(fan)應(ying)前加入染料(liao)，可(ke)以實(shi)現真正的閉(bi)管(guan)操作(zuo)，避免污染。但(dan)此時需要(yao)對原來的反(fan)應(ying)條件做一(yi)定的改變，通常需要(yao)增加Mg2+濃(nong)度2～3 mmol/L，增加退火溫度1～5℃。隨著(zhu)Mg2+濃度(du)的(de)(de)增(zeng)加，Tm值(zhi)也(ye)會升高(gao)(gao)，當(dang)Tm值(zhi)超過(guo)熔(rong)解設備所(suo)允許的(de)(de)最(zui)高(gao)(gao)溫度(du)時，還需(xu)要(yao)(yao)加入二(er)甲基(ji)亞砜DMSO(10％)或(huo)甜菜堿(0.5 mol/L)來降低Tm值(zhi)。在某些情況下，為快速找到反(fan)(fan)應體系(xi)最(zui)適的(de)(de)退火溫度(du)，需(xu)要(yao)(yao)做梯度(du)PCR試(shi)(shi)驗。在PCR反(fan)(fan)應程序的(de)(de)最(zui)后，一定要(yao)(yao)加入解鏈和退火的(de)(de)步(bu)驟，以(yi)增(zeng)加PCR產物的(de)(de)雜合度(du)，提高(gao)(gao)試(shi)(shi)驗的(de)(de)分辨率和準確(que)度(du)。

3. 引物的二聚體。PCR產物(wu)高純度(du)(du)(du)的(de)(de)(de)PCR特(te)異(yi)性(xing)(xing)產物(wu)是(shi)獲得HRM分析結(jie)果(guo)較高特(te)異(yi)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)前(qian)提，在PCR引物(wu)設計時，一定要避免(mian)引物(wu)的(de)(de)(de)二聚(ju)體(ti)和發卡(ka)結(jie)構，盡量降(jiang)(jiang)低基因組其(qi)他(ta)片(pian)段(duan)的(de)(de)(de)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)(xing)結(jie)合(he)。根(gen)據所用擴(kuo)增酶的(de)(de)(de)情況，要嚴(yan)格控(kong)制(zhi)PCR反(fan)應的(de)(de)(de)循環數，以(yi)降(jiang)(jiang)低非(fei)特(te)異(yi)性(xing)(xing)擴(kuo)增增加的(de)(de)(de)風(feng)險(xian)。根(gen)據試(shi)驗目的(de)(de)(de)，要嚴(yan)格控(kong)制(zhi)擴(kuo)增片(pian)段(duan)的(de)(de)(de)長度(du)(du)(du)。試(shi)驗結(jie)果(guo)表(biao)明，隨著擴(kuo)增片(pian)段(duan)長度(du)(du)(du)的(de)(de)(de)增加，HRM結(jie)果(guo)的(de)(de)(de)靈(ling)敏(min)度(du)(du)(du)和特(te)異(yi)性(xing)(xing)會降(jiang)(jiang)低，當擴(kuo)增片(pian)段(duan)長度(du)(du)(du)為(wei)400-1000 bp時，檢測(ce)(ce)(ce)的(de)(de)(de)靈(ling)敏(min)度(du)(du)(du)為(wei)96.1％，異(yi)性(xing)(xing)為(wei)99.4％。對于一些差異(yi)只有1-2 bp的(de)(de)(de)基因片(pian)段(duan)進行分型時，需(xu)要借助探針才能解(jie)決(jue)。擴(kuo)增子(zi)不(bu)能太長，當檢測(ce)(ce)(ce)大片(pian)段(duan)如(ru)整個外顯子(zi)或內(nei)含子(zi)的(de)(de)(de)突變位點時，就要使(shi)用多對引物(wu)，將(jiang)大片(pian)段(duan)分別(bie)擴(kuo)增檢測(ce)(ce)(ce)。同其(qi)他(ta)任何基于PCR反(fan)應的(de)(de)(de)突變檢測(ce)(ce)(ce)一樣，HRM不(bu)能檢測(ce)(ce)(ce)外顯子(zi)、內(nei)含子(zi)或整個基因(yin)等大片段(duan)的缺失突變。

4. 轉換純合突變子檢測。目的(de)片段突(tu)(tu)變(bian)或多態位(wei)點的(de)類(lei)型(xing)在轉換(huan)(huan)(huan)、顛(dian)(dian)換(huan)(huan)(huan)、插入和缺(que)失4大(da)類(lei)堿基突(tu)(tu)變(bian)類(lei)型(xing)中，雜合(he)突(tu)(tu)變(bian)子產生的(de)Tm值差異最大(da)，顛(dian)(dian)換(huan)(huan)(huan)純(chun)合(he)突(tu)(tu)變(bian)子的(de)Tm值差異在0.8～1.4℃之(zhi)間(jian)，HRM技(ji)術(shu)可以對(dui)其準(zhun)(zhun)確(que)分型(xing)。但轉換(huan)(huan)(huan)純(chun)合(he)突(tu)(tu)變(bian)子產生的(de)Tm值差異通常小(xiao)于(yu)0.4℃，HRM技(ji)術(shu)不能對(dui)其準(zhun)(zhun)確(que)分型(xing)，此時需要采用(yong)小(xiao)片段法或非標(biao)記探針(zhen)(zhen)法。使(shi)用(yong)小(xiao)片段法時，片段長度(du)一般設計為(wei)40～90 bp，包含1個SNP位(wei)點為(wei)宜。使(shi)用(yong)探針(zhen)(zhen)法時，熔解(jie)曲線上會出(chu)現2個峰(feng)圖，可以進行(xing)2次SNPs分析(xi)，且探針(zhen)(zhen)與(yu)其互補區結合(he)形(xing)成的(de)雙鏈部分更(geng)短，更(geng)能增加試驗的(de)靈敏度(du)，從而增加對(dui)純(chun)合(he)突(tu)(tu)變(bian)子的(de)分型(xing)準(zhun)(zhun)確(que)性。

5. 樣品的提取方法一致。樣(yang)品基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法樣(yang)品基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)不同的(de)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法會對PCR后(hou)產(chan)物(wu)熔解曲線的(de)形狀和分(fen)析(xi)結果產(chan)生很大的(de)影(ying)響(xiang)，因(yin)(yin)此，待分(fen)析(xi)樣(yang)品的(de)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法要一(yi)致。為(wei)找(zhao)出較(jiao)為(wei)合(he)適的(de)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法，實(shi)驗室可根(gen)據自身條件設計不同基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法對HRM結果影(ying)響(xiang)的(de)試驗，找(zhao)到較(jiao)為(wei)理(li)想(xiang)的(de)提(ti)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)法或較(jiao)為(wei)理(li)想(xiang)的(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)提(ti)取(qu)(qu)(qu)試劑盒。

6. 飽和熒光染料的差異LC-Green、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等飽和熒光(guang)染(ran)料的(de)性質差異不大，可(ke)以相互替代，試驗時只(zhi)需要對PCR緩沖液(ye)和反(fan)應條件做(zuo)微小的(de)調整即(ji)可(ke)。SYBR Green I染(ran)料為非飽和熒光(guang)染(ran)料，在(zai)檢(jian)測(ce)核酸微小變異時存在(zai)缺陷(xian)，因此(ci)一(yi)些研究者(zhe)們不建(jian)議采用。

四、HRM技術展望

HRM技(ji)術(shu)(shu)具有高通量、高靈敏度(du)和(he)(he)(he)特(te)異性(xing)(xing)、操作(zuo)簡單靈活、成本低、對(dui)DNA分(fen)(fen)子無損害、閉(bi)管操作(zuo)等諸(zhu)多優點。在(zai)畜(chu)牧業(ye)(ye)方面(mian)(mian)(mian)，通過對(dui)畜(chu)禽基因(yin)組突(tu)變(bian)位點的(de)(de)(de)(de)(de)關聯性(xing)(xing)分(fen)(fen)析(xi)和(he)(he)(he)連鎖性(xing)(xing)分(fen)(fen)析(xi)，HRM技(ji)術(shu)(shu)可(ke)以鑒定出(chu)更多的(de)(de)(de)(de)(de)與畜(chu)禽特(te)定經(jing)(jing)濟性(xing)(xing)狀(zhuang)相關的(de)(de)(de)(de)(de)SNPs位點，增(zeng)加(jia)畜(chu)禽參考群育種值估計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)準確性(xing)(xing)，還(huan)可(ke)以增(zeng)加(jia)畜(chu)禽分(fen)(fen)子疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)檢出(chu)率，并(bing)為(wei)其(qi)遺(yi)傳疾(ji)病(bing)和(he)(he)(he)基因(yin)突(tu)變(bian)所(suo)致疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子診斷提供(gong)革命性(xing)(xing)手(shou)段。在(zai)農業(ye)(ye)方面(mian)(mian)(mian)，HRM技(ji)術(shu)(shu)將(jiang)增(zeng)加(jia)作(zuo)物遺(yi)傳標記(ji)位點的(de)(de)(de)(de)(de)密度(du)，加(jia)快(kuai)作(zuo)物高產、抗逆性(xing)(xing)等優良(liang)性(xing)(xing)狀(zhuang)的(de)(de)(de)(de)(de)改(gai)良(liang)進度(du)。隨(sui)著消費者食(shi)品(pin)(pin)安全意識的(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)強和(he)(he)(he)行業(ye)(ye)競爭的(de)(de)(de)(de)(de)日趨激烈，對(dui)食(shi)品(pin)(pin)微量成分(fen)(fen)種類和(he)(he)(he)含量的(de)(de)(de)(de)(de)檢測日益重要，HRM技(ji)術(shu)(shu)因(yin)其(qi)較高的(de)(de)(de)(de)(de)靈敏度(du)和(he)(he)(he)特(te)異性(xing)(xing)，必將(jiang)發展(zhan)成為(wei)一種可(ke)靠便捷的(de)(de)(de)(de)(de)檢測手(shou)段。在(zai)人(ren)類疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)診斷方面(mian)(mian)(mian)，HRM技(ji)術(shu)(shu)必已經(jing)(jing)從(cong)試驗(yan)研(yan)究走向臨床(chuang)診斷，成為(wei)人(ren)類分(fen)(fen)子疾(ji)病(bing)臨床(chuang)診斷的(de)(de)(de)(de)(de)新手(shou)段。因(yin)此(ci)，HRM技(ji)術(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)應用范圍將(jiang)會進一步拓寬，并(bing)越來(lai)越受到核酸研(yan)究者的(de)(de)(de)(de)(de)重視。

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